图7 Url1突变体表型分析 (Fang et al., 2021)。作者发现与WT的扁平叶片相比，Url1突变体的叶片卷成圆筒状，F1的叶片呈半卷状（A-C），用甲苯胺蓝O染色发现在WT中，沿大叶脉和小叶脉被染成紫色的泡状细胞排列成三列，在Url1突变体中只观察到两列（D-G），WT和Url1成熟叶片的横切面（H-M），WT和Url1的LRI（N）、泡状细胞数量（O）和面积（P）。备注：泡状细胞数量和大小的减少会使叶片卷曲。
图8 URL1基因的图位克隆 (Fang et al., 2021)。作者利用图位克隆技术鉴定出在突变体Url1中LOC_Os06g10600的终止密码子后第679nt处发生了一个单碱基替换（A），该突变位点位于LOC_Os06g10600的3’-UTR区，将LOC_Os06g10600命名为URL1，该基因编码HD-ZIP IV家族转录因子ROC8。在Url1突变体中，URL1的3’-UTR中保守基序的单碱基突变，增强了URL1 mRNA的稳定性，使得URL1基因在突变体中的表达量显著高于野生型（B）。
图9 URL1基因调控水稻叶片近轴卷曲的模型 (Fang et al., 2021)。作者建立了水稻叶片卷曲分子调控网络，在Url1突变体中，3’-UTR第二个基序CNS2中的C-T替换增加了mRNA的稳定性和丰度，丰富的URL1蛋白与另一个HD-ZIP IV家族成员ROC5和转录抑制辅助因子TPL2形成转录抑制复合物抑制ACL1基因的表达，使泡状细胞的数量和大小减少，从而形成近轴卷曲的叶片。
1.2.3 内含子的单碱基变异
内含子是真核蛋白质编码基因的标志，我们最熟悉的是内含子的选择性剪接会增加蛋白质的多样性，本小节由于内含子单碱基变异造成植物性状变化的例子也是源于此原因，但其实内含子还有其他的功能，例如内含子可调节基因表达、mRNA输出等，大家可以多多探索喔！
2013年，哥伦比亚大学Li Xin团队在Nature communications杂志上发表了题为“Mitochondrial AtPAM16 is required for plant survival and the negative regulation of plant immunity”的研究论文，该团队通过EMS化学诱变筛选出拟南芥snc1增强子突变体muse5，并且发现MUSE5和酵母PAM16同源，定位于线粒体内膜，首次揭示了拟南芥MUSE5/TXR1/AtPAM16负向调控R蛋白SNC1介导的免疫反应，再次证明了线粒体参与植物免疫反应，拓展了对植物R蛋白介导的免疫信号的认识 (Huang et al., 2013)。
图10 muse5-1的图位克隆 (Huang et al., 2013)。拟南芥SNC1是一种R蛋白，snc1突变体使SNC1异常活跃，可抗病原菌，植株矮小。mos突变体为snc1抑制子突变体，这些突变体在表型上与野生型基本一致，但也抑制了snc1的抗病性。作者想筛选出snc1增强子突变体，因此通过EMS诱变mos snc1双突突变体，得到了类似于snc1突变体的muse突变体，植株矮小且抗病。作者通过群体进行图位克隆，最终克隆到At3g59280发生了突变，突变的位置为内含子与外显子的剪切处，碱基G突变为A（a、b），对突变体的cDNA与野生型比较，发现碱基G在muse5-1中缺失（c），最终导致MUSE5蛋白改变。通过比对蛋白序列，发现MUSE5与酿酒酵母中的PAM16有35%的相似度，均存在J-Like保守结构域（e虚线处）。
