灭菌指标要杀死什么细菌

首页 > 体育 > 作者:YD1662024-01-17 22:00:45

一.前言

我们所生活的环境中,到处都存在着大量的微生物。在一般空气中,微生物达800~3500个/m3,在土壤中达1~500×108个/g,在严重污染的水中可达107个/ml。(饮用水要求细菌总数≤100个/ml,大肠杆菌≤3个/ml。经水塔或贮水池贮存后,短期内可繁殖至100000~1000000个/ml。)人的头皮上有140万个/cm2,两手上约有4~40万个,1g指甲污垢有38亿个,1g粪便可达10~1000亿个。可以说微生物是无处不在,无处不有。许多以前被人们认为是极端(高温、高压、强酸、强碱、低温等)甚至是致死的环境,现在已发现生活着各种类型的微生物(称为极端微生物)。事实说明,微生物有特别顽强的生存、繁殖和变异能力来适应环境。

微生物种类繁多,有的对人有益,有的有害,有的无益也无害。但在药品生产过程中,不可能对环境中的各种微生物加以区别对待,为保证药品的安全有效,需要对其进行控制。空气中的微生物多数附着在灰尘上,或以芽孢形式悬浮于空气中,1μm以下者处于悬浮状态,10μm以上者会逐渐沉下来而形成菌尘。所以也要对尘粒进行控制。

大量临床资料表明,注射剂(尤其是静脉注射剂)如污染了7~12μm的尘粒,可导致热原反应、肺动脉炎、微血栓或异物肉芽肿等,严重的还会致人死命。而如果污染了细菌,轻则局部红肿化脓,重则引起全身细菌性感染。因此,对微生物和尘粒进行更加严格的控制对于针剂生产洁净室非常重要。

人是洁净室最大的污染源,占90%左右。一般男性每人每分钟向周围排放1000个以上的含菌粒子,女性为750个以上。穿无菌服时,静止时的发菌量为10~300个/min,一般活动时发菌量为150~1000个/min,行走时发菌量为900~2500个/min。咳嗽一次发菌量为70~700个/min,喷嚏一次为4000~60000个/min。所以在洁净室中,人的数量和活动应有特别严格的限制。

二.微生物简介

微生物是广泛存在于自然界的一群体形微小(直径小于1mm)、结构简单、肉眼看不见,必须藉助光学或电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的生物。需要说明的是,微生物是一个比较笼统的概念,界线有时非常模糊。如单细胞藻类和一些原生动物也应算是微生物,但通常它们并不放在微生物中进行研究。

微生物具有以下特点:①体积小,面积大;②吸收多,转化快(2000倍体重/h);③生长旺,繁殖快(20min分裂一次);④易变异,适应强;⑤分布广,种类多(10万种以上)。

微生物按其结构、化学组成及生活习性等差异可分成三大类:

1.真核细胞型 细胞核的分化程度较高,有核膜、核仁和染色体;胞质内有完整的细胞器(如内质网、核糖体及线粒体等)。真菌属于此类型微生物。

2.原核细胞型 细胞核分化程度低,仅有原始核质,没有核膜与核仁;细胞器不很完善。这类微生物种类众多,有细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体和放线菌。

3.非细胞型 没有典型的细胞结构,亦无产生能量的酶系统,只能在活细胞内生长繁殖。体积微小,能通过除菌滤器。病毒属于此类型微生物。

微生物在自然界中的分布极为广泛,空气、土壤、江河、湖泊、海洋等都有数量不等、种类不一的微生物存在。在人类、动物和植物的体表及其与外界相通的腔道中也有多种微生物存在。

绝大多数微生物对人类和动、植物的生存是有益而必需的。自然界中氮、碳、硫等多种元素循环靠微生物的代谢活动来进行。例如空气中的大量氮气只有依靠微生物的作用才能被植物吸收,土壤中的微生物能将动、植物蛋白质转化为无机含氮化合物,以供植物生长的需要,而植物又为人类和动物所利用。因此,没有微生物,植物就不能新陈代谢,而人类和动物也将无法生存。

另一方面,由极少数微生物引起的传染病发病快、死亡率高、传播迅速、传播范围广,严重危害着人民健康。

三.微生物的形态结构

1.细菌(原核单细胞生物)

细菌按形状可分为:球菌(0.5~2μm)、杆菌(长1~5μm,宽0.3~1μm)和螺形菌(大小与杆菌相似)。

按革兰氏染色法染色的不同,分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌的细胞壁表面含较多的磷壁酸,会产生外毒素,如金黄色葡萄球菌;革兰氏阴性菌的细胞壁表面多含脂蛋白和脂多糖,会产生内毒素(即热原),如大肠杆菌。

细菌一般有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核,有的还有荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞等特殊结构。

细菌一般为无性繁殖,以二分法繁殖,几十分钟或1~2小时分裂一次。

资料:关于芽孢

在温度逐渐降低或营养缺乏时,芽胞杆菌属(如炭疽杆菌)及梭状芽胞杆菌属(如破伤风杆菌)能在菌体内形成一个折光性很强的不易着色小体,称为芽胞。芽胞是处于休眠状态的细菌,并非细菌的繁殖体,当环境适宜时,可恢复生长繁殖。

芽胞在自然界分布广泛,要注意防止污染。芽胞的抵抗力强,对热力、干燥、辐射、化学消毒剂等理化因素均有强大的抵抗力,用一般的方法不易将其*死。有的芽胞可耐100℃沸水煮沸数小时。*灭芽胞最可靠的方法是高压蒸汽灭菌。当进行消毒灭菌时往往以芽胞是否被*死作为判断灭菌效果的指标。

2.霉菌(丝状真菌的通称,真核多细胞生物)

霉菌是真菌的一部分。在培养基上长成绒毛状或棉絮状的菌丝体的真菌统称为霉菌。

霉菌细胞呈狭长的管状,称为菌丝。菌丝直径比细菌、放线菌大,约2~10μm。菌丝分枝连接,交错集合在一起的总体称为菌丝体。

霉菌大多数是多细胞微生物,菌丝细胞由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和各种细胞器组成。细胞壁很薄,往往在表面产生色素,使菌落出现各种颜色。

霉菌靠孢子繁殖,有无性繁殖和有性繁殖两种方式,以无性繁殖为主。

有些真菌可用酿酒造酱,或用于发酵生产柠檬酸、葡萄糖酸、酶、抗生素(如青霉素、头孢菌素);少数真菌能引起各种真菌病。真菌产生的真菌毒素(如黄曲霉素)有毒。

3.酵母菌(真核单细胞生物,属真菌)

酵母菌以单细胞存在,呈圆形、卵圆形和香肠形,比细菌大,细胞长5~30μm,宽1~5μm。细胞结构有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核和各种细胞器等。

酵母菌的增殖分无性繁殖和有性繁殖两个阶段,有三种方式:芽殖、裂殖、孢子生殖。

酵母菌是重要的工业微生物,用于酿酒,生产单细胞蛋白、B族维生素、核酸、辅酶A、细胞色素C等。一般对人体无害。

4.放线菌(原核单细胞生物)

放线菌有生长发育良好的菌丝体,呈分枝状,菌丝宽为0.2~1.2μm,革兰氏阳性。其内部构造与细菌相似,无完整的细胞核。菌落常呈辐射状,因此称放线菌。

繁殖方式为无性孢子繁殖。最适pH6.7~7.5,温度25~30℃。

放线菌可用于生产抗生素、维生素和酶类,少数可引起人畜放线菌病。

5.病毒

病毒是一类体积十分微小,结构简单,只含一种核酸(DNA或RNA),没有产生能量的酶系统,只能在活细胞内以复制方式增殖的非细胞型微生物。病毒在自然界分布非常广泛,在所有其它生物中都有病毒寄居。病毒是最常见的致病微生物,人类传染病中大约75%是由病毒引起的。

病毒体主要由核酸和蛋白质组成。病毒体积微小,最大直径300nm(如牛痘病毒),最小直径20nm(如口蹄疫病毒),绝大多数在150nm以下,能通过细菌滤器,用普通光学显微镜看不见,必须用电子显微镜放大数千至数万倍才能看见。形态多呈球形,少数为杆状或砖形。噬菌体(细菌病毒)有呈蝌蚪状的。

朊病毒于1982年发现,它很特殊,与一般病毒不同,是一种异常蛋白质,不含有核酸。与疯牛病(牛海绵状脑病)及人克雅氏病关系密切。其复制方式不明。

四.微生物的营养

1.水分:水占细胞浆的70%~90%,是细胞的重要组成成分。较普遍的观点认为:只有在含水的环境中微生物才能存活。但也有人发现在无水碳氢化合物中微生物可长期存活。

2.碳源:碳源是构成细胞的重要物质。有些微生物的碳源必须来自有机碳化合物如糖、蛋白质、脂肪、有机酸等(同时利用其化学能),属异养型;有些微生物不需有机碳化合物,以CO2为碳源,属自养型(分为光能自养型和化能自养型)。

3.氮源:氮是组成蛋白质和核酸的重要元素。

4.无机盐类:细菌所需无机盐包括磷、硫、镁、铁、钾、钠、钙、氯、锰、锌、钴、铜等。其中磷、硫、镁、钾、钠、铁需要量较多,其他只需微量。

5.生长因子:生长因子是某些微生物生长发育所必需,而其自身又不能合成的一类营养物质。包括维生素、嘌呤和嘧啶等。

五.微生物生长的影响因素

1.营养物

2.pH值:各种微生物都有其最适宜的pH值,大多数细菌最适pH为6.8~7.4,但一般有较大的容忍度,在4~9也可存活和生长,少数细菌能在极端pH值范围内生长。真菌适于pH值3~6的微酸性环境,但在2~10也可生长。

3.温度:微生物适于生长繁殖要有适宜的温度,当超过其最低或最高可耐受的温度时,即停止生长或死亡。一般细菌最适温度为30~40℃,真菌为20~30℃。

4.氧气:大多数细菌和所有霉菌都是需氧菌(在有氧环境中才能生长),少数细菌是厌氧菌(在无氧环境中才能生长),有些细菌和酵母菌是兼性需氧厌氧的,在有氧或无氧环境中都能生长繁殖。

5.渗透压:微生物细胞膜和所有生物膜一样是一种半透膜,可让水自由通过,对溶质则有选择性。由于细胞壁的保护,微生物能存活在低渗透压的水中。而在高渗溶液(如高浓度的盐溶液或糖溶液、40%甘油)中,细胞会脱水并停止生长繁殖。但也有一些专性耐高盐细菌只有在高盐(10~15%)条件下才生长。

6.表面张力:表面活性剂可降低表面张力,它是影响细菌生长的因素之一。很多革兰氏阴性菌,特别是大肠菌群可很好地在表面活性剂包围的介质中生长,而大多数革兰氏阳性菌在表面张力低时(0.05N/m)不能很好生长。阳离子表面活性剂对很多有机体有毒性,阴离子表面活性剂毒性很小,非离子表面活性剂几乎没有毒性,并可成为某些微生物的营养物。

六.消毒与灭菌

消毒与灭菌是微生物实验技术中最基本的操作,从事药品生产和检验的人员都应当了解消毒与灭菌的方法及其意义,严格遵守操作规程,否则会影响产品质量,危害患者安全。

1.概念

Ø无菌——不存在活的生物(GMP指南)。

“无菌”从定义上来说是一个绝对的概念,但遗憾的是,在科学和技术高度发展的今天,药品的绝对无菌即做不到,也无法加以证实。然而,无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准。

FDA、欧洲制药工业界曾将百万分之一微生物污染率作为灭菌产品“无菌”的相对标准,它和蒸汽灭菌后产品中微生物存活的概率为10-6(即产品的无菌保证值为6),系同一标准的不同表示法。这一标准于1980起收录于USP XX中,如今已为世界各国普遍接受和采用。

Ø灭菌——使达到无菌状态的方法(GMP指南)。用物理或化学方法*灭传播媒介上所有的微生物,使其达到无菌(GB)。通常是指*灭或除去全部活的微生物(包括繁殖体和芽孢)。

Ø消毒——用物理或化学方法*灭或清除传播媒介上的病原微生物,使其达到无害化(GB)。通常是指*死病原微生物的繁殖体,但不能破坏其芽孢。所以消毒是不彻底的,不能代替灭菌。

Ø无菌制剂——不存在活的微生物的制剂(GMP指南)。

Ø非无菌制剂——所含活的微生物量符合卫生学标准的制剂(GMP指南)。

2.常用消毒剂

消毒剂

常 用 量

用  途

乙醇

① 70%~75%水溶液

② 0.5%洗必泰溶于70%乙醇,再加入2%甘油

用于皮肤、器具等消毒

供洗手用消毒

异丙醇

75%水溶液

用于皮肤、器具等消毒

甲醛

37%~40%甲醛液8~9ml,再加入4~5g高锰酸钾

每m3熏蒸量,密闭12~24h。刺激性强

戊二醛

2%水溶液

用于空气、器具等消毒。广谱、高效、低毒,可*芽孢和病毒。刺激性较轻。

新洁尔灭(苯扎溴铵)

0.1%水溶液

用于皮肤、粘膜、器具等消毒,有清洁和消毒双重功效。抗菌谱较窄。

杜灭芬(消毒宁)

0.05%~0.1%水溶液

用于皮肤、器具等消毒

过氧乙酸

① 0.2%~0.5%水溶液

② 新配0.5%水溶液

③ 1g/m3

用于器具等消毒   抗菌谱广,可

用于皮肤消毒    *灭某些病毒

熏蒸        但性质不稳定

乳酸

① 0.33~1mol/L

② 1~1.5ml/m3熏蒸或与等量苯酚合用熏蒸

喷雾,用于空气消毒,有强*菌作用

熏蒸,密闭12h以上

麝香草酚

5%麝香草酚溶于50%乙醇

喷洒墙面、地面,*霉菌

3.常用灭菌法

1)干热灭菌法 常见的有火焰、烧灼、干烤和红外线灭菌等。

①火焰、烧灼:通常用于实验室无菌操作中金属或其它耐火材料制成的器具的灭菌。

②干烤和红外线:利用干热空气或热辐射进行灭菌。一般135~145℃需3~5h,160~170℃需2h以上,170~180℃需1h以上,180~200℃需0.5~1h。除热原则需250℃30min,或200℃45min,180℃2h。

空气传热慢,穿透力不强,故干热灭菌时间长。干热灭菌时烤箱内装入物品应留有空隙,以利空气流动,否则使箱内温度不均,部分物品灭菌不彻底。

2)湿热灭菌法 通过热蒸汽或沸水使蛋白质变性而*灭微生物的方法。湿热穿透力强,灭菌效果较干热好。

①煮沸或流通蒸汽灭菌:常压下沸水和蒸汽的温度是100℃,一般处理30~60min可*死细菌繁殖体,但不能完全*灭芽孢。此法适用于不能高压蒸汽灭菌的物品。

②低温间隙灭菌(巴斯德灭菌法):将物品先用60~80℃加热(或煮沸)1h,然后置20~25℃保存24h(或常温过夜),使其中残存的芽孢萌发成繁殖体,再用以上条件灭菌,如此反复三次。本法适用于不耐高温或高温下易变质的物品,但很费时。

③高压蒸汽灭菌(热压灭菌法):超过一个大气压时,水的沸点高于100℃,反之亦然。高压蒸汽灭菌就是通过加压提高蒸汽温度,灭菌效果最好。它简便、经济、可靠、无毒,是最可靠、应用最广泛的灭菌法。此法适用于耐高温和潮湿的物品。常用条件为:

115.5℃ 30min

121.5℃ 20min

126.5℃ 15min

注意事项:

a. 必须完全排出灭菌器内的空气。否则会影响灭菌器内温度达到规定的要求。

b. 注意被灭菌物品的温度。灭菌器内温度与被灭菌物品的温度一般是一致的,但在蒸汽输入过快时,后者可能低于前者,所以升温时要有一定的预热时间。另外,降温过快易引起玻璃炸裂。因此,对于一种灭菌产品,应制定一固定的灭菌曲线(象冻干曲线一样)。

c. 定期检查灭菌器内温度的准确性。

3)化学灭菌法 利用化学试剂形成的气体来*灭微生物的方法。常用的灭菌剂为环氧乙烷(又称氧化乙烯)。环氧乙烷是广谱*菌剂,能*灭细菌、芽孢和多种病毒,还能*死昆虫及虫卵。但由于环氧乙烷易燃易爆且有毒(有致变异性),用于药品方面极有限,多用于医疗器械、塑料制品等灭菌。(不能用于橡胶和乳胶手套,能将其溶解。)

4)滤过除菌法 利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理,除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。过滤法一般只能除菌,不能除去支原体和病毒。

过滤除菌的效果与滤膜的性能、孔径的大小、密度、滤膜的厚度等因素有关。

滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为0.22μm。由于各厂家生产的相同规格的滤膜质量并不一致,为了保证除菌效果,在使用前后应检查滤器的完好性(如压力维持试验或起泡点试验)。

一个过滤器的使用时间应根据品种验证后确定,一般不应超过8小时。

5)辐射灭菌法 辐射有两种类型:一种是电磁波辐射,如紫外线、红外线、微波;一种是电离辐射,如可引起被照射物电离的X射线、γ射线。

①紫外线:紫外光波长在136~390nm之间,其中260nm左右能破坏核酸,*菌作用最强。另外,空气中的氧受紫外线照射后,可微量转变为臭氧共同起*菌作用。紫外线消毒的效果与光源的功率、光源与被照射物的距离、照射时间、温度和湿度等因素有关。我国规定紫外灯照射强度在距离1m处不低于70μW/cm2(以紫外线测强仪测定)。在操作面上要求强度达40μW/cm2以上。一般每10m2装30W灯管1支,工作前开30~60min。

紫外灯的输出功率随使用时间增加而降低。国产紫外灯的平均寿命(点到70%额定功率的时间)一般为2000h,超过平均寿命时,就达不到预期效果,必须更换。

紫外线的穿透力很弱,不能穿透一般包装材料,如玻璃、塑料薄膜、纸等。玻璃能强烈吸收小于350nm的紫外线,石英玻璃能吸收小于200nm的紫外线。因此,它主要用于空气和物体表面消毒,特制的紫外灯装置也可用于水的消毒。

紫外线对眼、皮肤有损坏,照射过程中产生的臭氧对眼、鼻腔有刺激,臭氧过多时使人头晕、胸闷、血压下降。

②红外线:通过加热碳化硅板产生的辐射热能,由空气传导加热灭菌。如红外线烤箱,温度可达180℃左右。热效应特点是由表及里。

③微波:微波灭菌主要是因其热效应。微波加热升温快,温度高且均匀,*菌作用强。热效应特点是由里及表。不同性质的物品吸收微波的能力不同,其热效应和消毒效果也不同。

微波有一定穿透力,但不强。微波对人体有害,要注意防护。

④60Co灭菌:放射性同位素60Co(或137Cs)衰变时可放射出γ射线,γ射线的能量高、穿透力强,可使细胞内各种活性物质发生化学变化,从而使细菌损伤或死亡。

经60Co辐射灭菌的物品温度升高很少,一般仅约5℃,故又称“冷灭菌”。

60Co辐射存在两个方面的安全问题:一是辐射的直接作用。γ射线对人体细胞同样有害;二是经过辐射的食品、药品的安全性。1984年美国农业部食品安全实验室用辐射处理的鸡肉喂饲小鼠,发现患睾丸肿瘤增加,包括加重癌病损害。因此60Co辐射用于食品和药品都应经过安全试验,进行科学的、全面的评价,高剂量的辐射药品更应慎重。

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