库提人在两河流域的统治被乌鲁克人所终结，然而乌鲁克人有很快被乌尔人打败，大约在公元前2113年乌尔人建立了统一两河流域南部诸城邦的乌尔第三王朝。这个王朝的第一代国王乌尔纳姆留给后人一部《乌尔纳姆法典》，尽管这部法典早已在历史长河中逐渐失传，但仍被公认为人类文明史上现存的最早的成文法。乌尔第三王朝一共历经5代国王，这些国王都喜欢穷兵黩武、大兴土木，激起了国内平民的反抗。到了末代国王伊比辛统治时期乌尔第三王朝同时遭受来自东面的埃兰人和来自西北方向的阿摩利人的攻击，大约在公元前2006年左右伊比辛被埃兰人俘获。然而俘获了伊比辛的埃兰却没能成功控制住两河流域的局势，在此之后两河流域重新陷入到小国争战的状态。
在长期的小国争战过程中位于幼发拉底河畔的巴比伦城邦逐渐脱颖而出——这是一个由闪米特人的阿摩利部族在公元前2200年前后建立的城邦。在经历与邻邦近一个世纪左右的争夺之后巴比伦迎来了他们的第六代首领汉谟拉比：巴比伦人在汉谟拉比的率领下与伊拉姆人展开了长达30年左右的战争，最终汉谟拉比赢得了战争的胜利，统一了两河流域，此后两河流域也被称为巴比伦尼亚。汉谟拉比在统一两河流域后统治了这一地区12年：在这12年里他以勤政而闻名于世——来自全国各地的信使不断将地方上发生的各种事务汇报给汉谟拉比，而他总是在第一时间进行批复。他亲自研究农田灌溉技术和贸易规则，他设立中央政府机构，向地方委派总督，颁布统一的税制并将全国各地的水利设施置于统一管理之下。不过最令汉谟拉比声名大噪的还得算是《汉谟拉比法典》——由于《乌尔纳姆法典》的失传使这成为了世界上现存的古代第一部比较完备的成文法典。
巴比伦王国的边疆驻扎着确保国家安全的常备军，巴比伦的商人可以在国家军队的保护下安全地穿行于各城镇之间。这一时期巴比伦的神庙开始扮演起人类历史上最早的银行角色——神庙通过向商人借贷而促进商业的发展。随着商业的发展也使巴比伦的文化空前繁荣起来：比起之前的阿卡德王国、乌尔第三王朝而言：巴比伦王国是古代中东两河流域所有古王国中留存至今的考古遗迹和艺术作品最多的，这也是巴比伦王国成为古代两河流域文明最为典型代表的原因。大约在距今4000年前马通过商业贸易被带入巴比伦人的视线，从此这种动物将极大改变这一地区的历史：在此之前两河流域的游牧民族放牧的动物中并没有马，随着马被引入两河流域后获得马匹的不只有巴比伦人，还有周边的游牧民族，这就使游牧民族具有了更强的机动性。大约在公元前1595年赫梯人乘着马拉的战车从北部的小亚细亚半岛侵入两河流域灭亡了巴比伦王国。
除了赫梯人之外另一个部族也因为马匹的引入而大获其利——这个部族就是亚述人。亚述最早是位于底格里斯河中游西岸的一个城邦国家，大约立国于公元前2000年左右。亚述自立国之日起就以彪悍善战闻名，曾与统一两河流域的萨尔贡争雄，失败后被迫偏居一隅。公元前1815年—公元前1783年在位的国王沙马什阿达德一世在位时期亚述征服了埃什努那、马里等城邦，连日后统一两河流域的汉谟拉比也一度臣服于亚述，尽管后来汉谟拉比设计打败了亚述，迫使亚述人不得不再次蛰伏，然而随着巴比伦王国的覆灭使亚述人重新看到了希望：侵入两河流域的赫梯人是亚述人的世仇，在此之前赫梯曾征服过亚述，公元前1300年亚述人驱逐了赫梯人，成为两河流域的新主人。公元前883—前859年在位的亚述王纳西尔帕二世进行了卓有成效的军制改革：亚述军队开始用马匹和战车武装起来并普遍列装铁制兵器。亚述凭借强大的军事实力向西扩张，尽管遭到了大马士革等城邦的顽强抵抗，但这些抵抗最终都被亚述人粉碎了。
