然而,由于漫长的转化过程和每个构建体需要对许多转基因系进行表征,有限数量的杨树基因已成为转基因研究的目标。
瞬时转化法是对稳定转化法的补充,使基因功能分析更加高效。瞬时基因表达技术可用于拟南芥和水稻等模式植物以及玉米、马铃薯、大豆、番茄和小麦等作物植物。
在杨树中,一些研究成功地通过生物轰击、原生质体转染和农杆菌共培养证明了瞬时基因表达。
例如,在杂交杨树中,通过粒子轰击,叶片表皮和保护细胞瞬间转化为报告结构。
采用电穿孔法或聚乙二醇化学法对杨树叶组织原生质体和悬浮培养细胞进行瞬时转染。在稳定转化体再生之前,采用农杆菌共培养的方法检测了黑孢霉、毛毛霉和毛卡霉中报告基因的异位表达。
然而,这种转化分析有一定的缺点,例如需要昂贵的设备和与粒子轰击有关的用品。此外,杨树原生质体转染的转化效率相对较低,仅从幼苗中分离出一小块组织用于农杆菌共培养。
为了避免这些缺点,另一种瞬时试验,如农杆菌介导的渗透,将对杨树有用。该方法对拟南芥、葡萄、马铃薯、柳枝稷、烟草和番茄等几种植物进行转化,转化过程简单,操作简便,转化效率高。
瞬时转化技术可用于快速体内基因功能分析,如蛋白质亚细胞定位,蛋白质-蛋白质相互作用和启动子活性。
对于体内功能分析,报告基因如绿色荧光蛋白、GFP变体和萤火虫荧光素酶是分子和细胞生物学研究的常用工具。蛋白质亚细胞定位对于阐明蛋白质的细胞功能至关重要,可通过荧光融合蛋白的瞬时表达进行监测。
含有目标基因的报告基因构建体与GFP或其变体融合,并瞬间转化为植物细胞,通过报告基因的荧光可见细胞内定位。
荧光蛋白也用于体内蛋白质-蛋白质相互作用,如双分子荧光互补和荧光共振能量转移,可以可视化蛋白质-蛋白质相互作用和靶蛋白的亚细胞定位。
两种不同构建体的瞬时共转化技术是一种方便和实用的替代双转化转基因植物的方法,并允许测试几种构建体和组合。
除了荧光蛋白外,LUC还被用作报告基因,主要用于测量转录活性。与荧光蛋白相比,LUC报告蛋白具有相对较短的半衰期,因此适合于实时监测基因表达。
例如,生物钟相关基因的表达模式通过LUC报告基因分析得到了广泛的研究。
通常,这些检测使用生物发光来可视化表达由转基因植物的时钟启动子驱动的LUC基因的昼夜或昼夜节律。虽然关于植物时钟系统的研究主要是使用稳定的变压器进行的。