5 样品处理方法
5.1 提取方法
在生物样品中，TCs易与蛋白质结合，通常酸性或弱酸性溶液为良好的提取溶剂，如EDTA缓冲液（0.1mol/LEDTA-McIlvaine，pH4.0）、丁二酸溶液。这些提取溶剂一方面能有良好的组织渗透性，并可使蛋白质变性起到脱蛋白质的作用，另一方面，在酸性条件下，两性的TCs能完全质子化，在水溶液中溶解度最大，易从生物样品中释放出来。盐酸、高氯酸、磷酸等酸性溶液也被用作TCs的提取溶液。还有报道用pH7.2咪唑缓冲液提取TCs。
有机溶剂如乙酸乙酯、乙腈、甲醇、三氯乙酸等也可作为TCs的有效提取溶剂。乙酸乙酯与酸性水溶液混合使用对动物组织中TCs有很好的提取效率。
由于生物样品中常含有二价阳离子，它们易对TCs的提取效率造成干扰，使回收率降低，因此提取溶剂中一般都含有EDTA，EDTA能有效消除金属离子与TCs的螯合作用。
5.2 净化方法
5.2.1 固相萃取（SPE）
SPE是TCs净化的主要方法之一。TCs具有苯环、多种活性官能团，因此各种类型的SPE都能用于TCs的净化，SPE主要包括C18、阳离子交换柱、苯基SPE柱、SAX柱等（表2-23）。
Aoyama等研究发现，未经处理的C18柱由于硅胶基表面硅烷醇基的存在及残余的金属离子，易与TCs紧密结合，而不能获得好的净化效果；经EDTA处理、端基封闭的硅胶键合相或加样溶液中含有EDTA则可获得较好的效果。苯基SPE柱、环己基SPE柱也能有效地净化TCs。
Zhu等比较了OasisHLB与Sep-PakC18两种SPE柱对OTC、TC、CTC的净化效果。OasisHLB和Sep-PakC18经6mL甲醇和6mL水活化后，20ng/mL的OTC、TC、CTC的提取液（pH2.5）上样，分别经10mL 5%甲醇水和10mL纯水洗涤，最后分别以2.5mL TFA∶甲醇（1∶99）和10mmol/L草酸甲醇溶液洗脱，经氮吹干、ESI-LC-MS/MS检测。
5.2.2 金属螯合亲和色谱（MCAC）
近年来，许多学者将MCAC作为净化TCs在动物源性食品中残留分析的一种新型技术，该技术能获得较高的回收率和低的检测限。MCAC的吸附填料经过硫酸铜水溶液处理，将含有TCs的提取液经MCAC净化，TCs能与铜离子相互作用达到与其他杂质分离的目的，再以EDTA-McIlvaine缓冲液洗脱。
Stubbings等使用在线MCAC-（HP）LC系统对动物组织中TCs残留进行了检测分析。MCAC柱先加入25μL 50g/L硫酸铜溶液、500μL水进行活化，提取的样品以0.36mL/min的流速上样，经500μL水、500μL甲醇、500μL水洗涤，最后以KH2PO4-柠檬酸-EDTA洗脱；MCAC柱再用KH2PO4-柠檬酸-EDTA/甲醇/乙腈和KH2PO4-柠檬酸-EDTA平衡再生。
5.2.3 基质固相分散技术（MPSD）
MSPD能够依靠填料颗粒的机械剪切力和键合相C18的去垢剂作用，集样品匀浆、提取、净化过程于一体，具有样品处理速度快、节约溶剂等优点，被广泛应用于兽药残留的分析。Long等首次将MSPD应用于牛奶中TCs残留的检测，将C18、EDTA-Na2、草酸和添加OTC、TC、CTC的牛奶样品研磨混合，制成半固态装柱、淋洗，最后以乙酸乙酯-乙腈（1∶3）洗脱药物，蒸干复溶，用HPLC-PDA测定；以100～3200ng/mL浓度添加样品，回收率为63.5%～93.3%。
Brandsteterova等比较了SPE和MSPD的净化效果，结果表明，TC、OTC、CTC以100ng/mL浓度添加于牛奶、肉、奶酪中时，经SPE和MSPD净化后的回收率分别为48%～86%和89%～93%，LOD分别为15～22n/mL和30n/mL。MSPD还被用于鲶、牛奶中TCs多残留的分析。5.2.4 自动序列透析/痕量富集（ASTED）
ASTED系统主要由采样、透析、富集三部分组成，其中以透析池和痕量富集柱（TEC）为核心。ASTED的净化过程一般为:待测物提取后以水溶液稀释，将样品自动注入透析池，通过编程控制样品与透析液的流量及保留时间，使样品溶液中的待测物透过半透膜传递到透析液中，蛋白质等大分子物质或细胞碎片被除去，透析液流过TEC，待测物被富集，然后再通过自动柱切换洗脱液进入LC色谱柱进行分离和检测。Zurhelle等使用ASTED净化，检测TCs在蛋白、蛋黄及鸡血清中的残留。10g蛋白加入20g0.3mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH5.75）作为提取液，10g蛋黄加入30g0.3mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH5.75），混合匀质，振荡5min，取5g上清液用10g柠檬酸钠缓冲液稀释；2g血清直接以4g柠檬酸钠缓冲液稀释，再进行ASTED净化，流动相为0.06mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.0），TEC和LC色谱柱均为PLRP-S，检测波长为350/420nm。OTC、TC、CTC的LOD为11～15μg/kg，LOQ为34～45μg/kg。
此外，固相微萃取技术、微透析技术也被应用于TCs的检测，并可获得很好的净化效果。
6 残留分析方法
TCs在动物源性食品中残留的分析方法主要有薄层色谱法（TLC），毛细管电泳（CE），高效液相色谱法（HPLC），色质联用技术（LC-MS或LC-MS/MS）及免疫分析方法（RIA、ELISA）等。
6.1 薄层色谱法（TLC）
TLC又分为正相薄层色谱（NP-TLC）和反相薄层色谱（RP-TLC）。如表5-24所示，NP-TLC一般使用纤维素、硅胶、硅藻土等作为吸附层。总体而言，NP-TLC是一种简单的、不需特殊设备的分离方法，但在制板时却要花费大量时间消除TCs与金属离子的螯合作用，故通常在吸附剂和溶剂系统中加入EDTA以消除金属离子的影响。采用直接在TLC吸附板上喷射EDTA并进行活化来处理，但效果不佳。进一步改进后，将TLC吸附板在饱和EDTA水溶液中展开，使用前再进行活化，收到较好的效果。Oka等用该技术以高效TLC吸附板和氯仿-甲醇-5%Na2EDTA（65∶20∶5）的溶剂系统分离了8种TCs，并成功运用于蜂蜜中8种TCs的残留检测，检测限达到0.1mg/kg。
用RP-TLC分析TCs时，溶剂系统中通常加入草酸以消除金属离子的影响。RP-TLC溶剂体系中通常含有磷酸、柠檬酸、酒石酸、EDTA等以获得对TCs较好的分离效果，但脱尾现象比较严重；在RP-TLC溶剂系统中加入草酸后，可以消除TCs与金属离子的螯合作用，减少脱尾现象，但分离效果却不好。Oka等以同一溶剂系统对不同反相薄层板的分离效果进行了分析，研究发现，以甲醇-0.5mol/L草酸水溶液（1∶1）作为溶剂系统，C8薄层板能使TCs获得很好的分离效果，而C18薄层板可以很好地分离TCs的脱氢及差向异构化产物；以甲醇-乙腈-05mol/L草酸水溶液（1∶1∶4）作为溶剂系统，在C8薄层板上，可以使7种TCs（OTC、TC、CTC、DC、MINO、MTC、DMCTC）得到很好的分离效果，检测了在蜂蜜和动物组织中TCs的残留。
在用TLC分析TCs时，通常采用氯化镁、氯化铁、五氯化锑、硫酸、重氮化硝基苯胺、改进的坂口（sakaguchi）反应试剂、1，1-二苯基-2-苦基肼（diphenylpicrylhydrazyl）试剂及重氮盐等作为检测时的显色剂。Choma等通过对不同溶剂系统的选择和优化，可以同时检测TCs和喹诺酮类药物氟甲喹在牛奶中的残留，分离效果见图5-29。
为了进一步确证，FAB-MS已经引入了TLC对TCs在动物源性食品中残留的检测。
6.2 毛细管电泳（CE）
CE是近年来迅速发展起来的分离分析技术，其原理是根据不同组分在高压电场的作用下迁移速率的不同而达到对组分的分离。其特点是分析速度快、柱效极高，适合复杂样品中水溶性的带电或有不对称电荷中心的有机物或无机物质。
Chen等报道了同时测定牛奶、血清、尿中OTC、TC、CTC和DC的CE。样品经琥珀酸盐沉淀蛋白质，离心，取上层通过金属螯合亲和柱色谱净化，再以TrimethylsilanizedC18柱分离，TCs的回收率为40%～84%，RSD为3.3%～9.1%。
Hernndez等运用CE对猪肾脏、肝、肌肉组织中OTC的残留进行了分析，20mmol/L碳酸钠作为电解质溶液（1mmol/L的EDTA溶液调节pH至11.2），检测限低于MRL，肾脏、肝、肌肉组织经SPE净化处理，其LOD分别为160mg/kg、120mg/kg、85mg/kg，回收率平均为76%。Huang等以200mmol/L磷酸缓冲液（pH2.0）作为电解质溶液，对鲶中OTC的残留进行了检测，以0.1～5mg/kg添加时，平均回收率可达92.9%，RSD小于3.4%，如图5-30所示。
