质粒为基因的表达提供什么,基因表达和基因片段的区别

首页 > 上门服务 > 作者:YD1662023-11-08 01:00:51

使用集成模块进行集成的示例

我们创建了一个整合质粒,其中包含Pnmt1启动子(来自#4),C端GFP标签,kan选择标记(#8)和co20靶序列(#2),以表达Cut7与GFP的融合蛋白。

作为GOI(基因兴趣物),我们使用了野生型和cut31基因(10.7-1.2 kb)的3个截短突变体,总共进行了0次金门反应。

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将每种反应样品用于大肠杆菌细胞的转化,并选择在LB Amp培养基上生长的一些菌落进行小规模制备,使用NotI酶对质粒进行消化以确认连接是否成功。

成功连接的比例为:11/1(三次反应)、1/1(一次反应)和2/3(七次反应),表明使用这些材料进行金门反应能够有效地产生正确的质粒。

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在进行了三个金门样品的转化后,在LB Amp平板上观察到了30-150个转化的大肠杆菌菌落,选择了每个转化体中的5个菌落进行质粒小制备,并通过NotI酶切进行验证。

在这6个样品中,有2个、8个和1个分别显示出整合质粒〈2〉、〈3〉和〈1〉的正确连接,使用FseI酶对正确连接的整合质粒进行消化,并将线性化片段用于庞贝链球菌细胞的转化,以表达m樱桃微管蛋白或GFP-微管蛋白。

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实验选择在选择性培养基中生长的稳定转化体进行菌落PCR,以测试是否发生了准确的整合,大多数整合事件都是准确的和有效的,因为在菌株的八个菌落中有七个是阳性的。

将每种菌株的阳性菌落在富培养基中培养过夜,并使用显微镜进行观察,通过使用lifeact-GFP和lifeact-mCherry标记的肌动蛋白贴片和电缆,可以在所有三种构建体中使用传统的宽场显微镜进行可视化。

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