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首页 > 实用技巧 > 作者:YD1662023-12-04 17:03:08

在植物中,有两个家族的2-ODD酶参与生物活性GA的生物合成。对于从GA12到GA4的转化,GA 20-氧化酶将GA12的C-20氧化并移除,形成C19-GA的C-4至C-10的γ-内酯,即GA9。

GA 3-氧化酶将GA9引入一个3β-羟基

还有其他2-ODD酶家族参与GA的去活化,最早被鉴定并最为显著的是GA 2-氧化酶,其中许多在植物的应对胁迫反应中具有重要功能。

黄瓜等瓜果类植物中还存在其他GA去活化反应,由2-ODD酶催化。在发育中的南瓜种子中,GA 20-氧化酶(CmGA20ox1和CmGA20ox2)催化GA12的C-20氧化,形成三羧酸型C20-GA25。

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表达南瓜CmGA20ox1的植物表现出侏儒表型,这表明了这种酶在植物体内的降解功能,并表明了GA 20-氧化酶基因家族内的新功能化

从黄瓜种子中分离和表征的两个新的cDNA分子,编码的蛋白质的氨基酸序列与GA 3-氧化酶家族成员高度相似。

其中之一是追加到已知的四个GA 3-氧化酶之中的,因此被命名为CsGA3ox5。这种酶编码了一种新的黄瓜GA 3-氧化酶,可以将GA9转化为生物活性的GA4。

第二种酶,命名为CsGA1ox/ds,没有GA 3-氧化酶活性,而是产生几种代谢产物。其中CsGA1ox/ds的主要产物之一,GA61,与最近发现的小麦GA 1-氧化酶的作用类似,是由底物GA9生成的。

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CsGA1ox/ds在植物中的降解功能,在拟南芥中过表达CsGA1ox/ds,植物会发展成侏儒表型,但可以通过外源施用生物活性GA4来挽救。

通过将其三个氨基酸Phe93,Pro106和Ser202更换为Tyr93,Met106和Thr202,CsGA1ox/ds被改造成了具有GA 3-氧化酶活性的变体,部分丧失了其降解功能。

表达改造后的GA1ox/ds(Y93,M106,T202)的拟南芥表现出加速生长和发育的特征,通过将CsGA3ox5的Tyr128,Met141和Thr237这三个氨基酸分别更换为Phe128,Pro141和Thr237,改造后的酶的GA 3-氧化酶活性完全消失。

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从成熟或浸泡的黄瓜种子中克隆了两个GA 3-氧化酶样的cDNA分子。这两个蛋白质都具有2-氧戊二酸依赖双氧酶的典型保守氨基酸序列,包括2-氧戊二酸和铁结合位点,并且在系统发育上与已知的GA 3-氧化酶密切相关。

其中一个GA氧化酶(命名为CsGA3ox5)具有类似于其他GA 3-氧化酶中发现的典型结构域。另一个(命名为CsGA1ox/ds)与CsGA3ox5密切相关(氨基酸一致性为55%),与其他GA 3-氧化酶的保守结构域仅在几个氨基酸上存在差异,包括Phe93,Pro106和Ser202。

CsGA1ox/ds的同源基因在甜瓜种子中也有表达(CumGA1ox/ds-like,氨基酸一致性为77%)。 通过在大肠杆菌BL21中表达相应的编码序列pET101/D-TOPO®,并将细胞裂解液与14C标记的GA底物一起孵育,研究了*CsGA1ox/ds和CsGA3ox5的催化特性。

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