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首页 > 实用技巧 > 作者:YD1662023-12-04 17:03:08

碳-3位3β-羟基化生成生物活性GA4

CsGA1ox/ds具有降解功能,因为如果在拟南芥中过表达,得到的转基因植株会发展出与过表达GA 2-氧化酶相似的强烈侏儒症状,而外源植物激素GA4的施用可以恢复到对照植株的表型。

*CsGA1ox/ds缺乏GA 3-氧化酶活性,它将前体GA9的1β位羟基化生成GA61。

从面包小麦中鉴定出一种结构同源于GA 3-氧化酶家族的GA 1-氧化酶,与面包小麦不同,CsGA1ox/ds是一种多功能酶,它通过其9,11-脱饱和酶活性将GA4转化为GA88。

它还将C20-GA12作为底物,生成几种未知的类似于赤霉素的分子,成熟的黄瓜种子中存在内源性的化合物c,支持了GA1ox/ds在种子发育过程中对GA降解的作用。

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CsGA1ox/ds的铁结合位点中的第三个氨基酸Ser202与GA 3-氧化酶中保守的氨基酸不同。在瓜中存在一种类似于CsGA1ox/ds的基因,编码一个具有相似氨基酸组成的蛋白质,而且其他植物物种中可能也存在类似的同源基因。

用GA 3-氧化酶家族中存在的氨基酸Tyr93、Met106和Thr202分别替换了CsGA1ox/ds的这三个特定的氨基酸,构建了GA1ox/ds(Y93,M106,T202)的工程化表达物

*GA1ox/ds(Y93,M106,T202)主要显示出3β-羟基化活性,除此之外还具有GA 1β-、2β-和GA 13-氧化酶活性。

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TaGA1ox1在系统发育学和功能上与GA 3-氧化酶关系不太密切,这表明在这种酶中,GA 1-氧化酶活性可能会覆盖潜在的GA 3-氧化酶活性。

GA活性通过在拟南芥种子成熟的中期发育阶段表达降解性细胞色素P-450单加氧酶和GA甲基转移酶进行紧密调节。

黄瓜类植物在种子发育的早期和中期表达降解性的CsGA1ox/ds,当降解性GA 2-氧化酶不表达时,用于微调种子发育的GA内稳态。

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在从发育中的南瓜胚胎制备的无细胞酶系统中,表达了一个降解性的GA 20-氧化酶,CmGA20ox1,可能代替这些组织中的GA 2-氧化酶活性

仅有少数氨基酸的变化就可以将降解性的CsGA1ox/ds转变为具有生物活性的GA 3-氧化酶功能,这意味着GA 3-氧化酶基因家族内的新功能化,就像在黄瓜类植物中发现的GA 20-氧化酶家族一样。

使用特定的引物将黄瓜中的GA 3-氧化酶基因的编码序列作为模板,进行聚合酶链式反应(PCR)来扩增cDNA序列。

PCR产物纯化并克隆到表达载体中,然后在大肠杆菌中异源表达这些基因。

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