在构建了能够更快解离的OmCI形式后，开始开发从血清中亲和纯化C5的方法。N-末端标签进行生物素化的OmCI蛋白被捕获在一株链霉亲和素柱上。分馏的血清被应用到柱上，测试了C5的洗脱条件。
使用WT OmCI（koff = <1.0E-5 s^-1），C5被捕获，在2 M NaCl或3 M MgCl2下均不能洗脱。pH梯度，C5在pH约2.8时洗脱，形成了乳白色的沉淀，用1 M Tris中和来逆转。
遵循“金ilocks原则”，找到一个具有理想动力学特性的突变体，以便捕获C5，具有适当减弱的koff，以在温和条件下解离并洗脱。
进行小规模的纯化实验，按照它们的更快解离顺序测试这些突变体作为捕获试剂。E141A单突变体（koff = 3.0E-4 s^-1）无法NaCl或MgCl2洗脱。亲和力的降低对pH梯度只有轻微影响，C5仍然在pH约2.8时洗脱。
E141A/H164A双突变体（koff = 4.0E-3 s^-1）是下一个作为亲和纯化试剂测试的突变体。这个突变体，C5被捕获，2 M NaCl或3 M MgCl2洗脱。C5对高NaCl的洗脱反应不佳，在2 M洗脱时不可逆地沉淀，在1 M下在一个宽阔、平坦的峰中洗脱。
相反，3 M MgCl2给出了一个尖锐、对称的洗脱峰，分数中没有可见的沉淀。测试了较低浓度的MgCl2，可以使用2 M的溶液洗脱C5，使用1 M的溶液洗脱时峰的尾部有一些延展。
经过凝胶过滤步骤后，测试了纯化后的C5以确定其质量和功能活性。最终的物质SDS-PAGE纯净，热熔曲线与商业可获得的C5一致，DSC测试，它与WT OmCI在多周期动力学实验中表现出高亲和力，KD < 100 pm。
该物质在一种替代途径（AP）激活ELISA中具有功能活性，可以恢复C5耗尽的血清的活性，pEC50为7.1 -log M。E141A/R47A双突变体（koff = 3.2E-2 s^-1）的解离速率过快，无法在洗脱之前在柱上保持C5。
C5-OmCI相互作用的体外和生物物理学分析已经确定了对高结合亲和力有重要贡献的残基。展示了OmCI-C5相互作用的复杂性和比之前认为的更高的亲和力，证明了亲和力减弱的OmCI作为纯化试剂的实用性。使用MOE进行的体外突变分析识别出七个能够显著改变结合能的残基，其中包括五个带电残基，可能有助于形成盐桥或氢键。
C5-OmCI-RaCI晶体结构表明C5和OmCI之间存在两个离子相互作用，源自于Glu-141OmCI和Arg-1226C5之间的双齿盐桥。实验上，E141A突变是最有效的单一突变，突显了盐桥相互作用的重要性。
其他极性残基在C5上缺乏合适的带电对应残基，无法进行离子相互作用，进行链间氢键。在结构中，His-164OmCI和His-117OmCI似乎与Pro-1221C5和Ser-1236C5的骨架羰基基团分别形成氢键。两个残基似乎形成了双齿氢键：Asp-167OmCI与Arg-955C5和Arg-956C5的骨架酰胺基团形成氢键；Arg-47OmCI与Asn-1221C5的侧链羰基和酰胺基团形成氢键。
实验上，氢键残基的亲和力排序大致与MOE的预测一致，其中H164A < D167A < H117A的KD。在MOE中的分析高估了H164A突变对E141盐桥去除的影响，低估了R47A突变的重要性。H164A突变被预测为最具减弱作用的单一突变，发现它不如E141A或R47A有效。
